一.熒光強度與溶液濃度的關系

    熒光是由物質(zhì)吸收光能后發(fā)射而出，因此，溶液的熒光強度 F 和溶液吸收光能的程度以及物質(zhì)的熒光頻率有關：

                 F ∝（I₀-I_t）→ F = K^’（I₀-I_t）                          (2)

K^’ 為常數(shù)，取決于熒光物質(zhì)的量子效率F，根據(jù)L—B定律：

所以   F = K’ ( I₀-I₀10^-ebc) = K’ I₀ ( 1-10^-ebc)  = K’ I₀ ( 1-e^-2.303ebc )   (3)

    將式中 e^-2.303ebc 展開，得

   (4)

    當 2.303ebC£ 0.05 時(濃度很小，溶液較稀時)，上式括號內(nèi)第一項以后的各項均可忽略不計，所以：   

F = K’I₀2.303ebc                        （5）

  對于一熒光物質(zhì)的稀溶液，當 I₀ 及 b 一定時，

F=K·c                         （6）

     即在低濃度（2.303ebc £ 0.05）時，溶液的熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度呈（線性）正比關系。

二. 定量分析方法

 1. 工作曲線法：

    配制一系列濃度梯度的待測物的標準溶液，同空白溶液，使樣經(jīng)過相同的處理之后分別測定熒光強度：F_s、F₀、F_x，然后作（ F_s - F₀）— c 曲線，根據(jù)（F_x–F₀)，從工作曲線上求得待測物的濃度（或含量）。

 2. 直接比較法 ：

    如果熒光物質(zhì)溶液的工作曲線通過原點，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進行測定：     

       F_s¯F₀ = Kc_{S ，}   F_x¯F₀ = Kc_x                                 （7）

三. 影響熒光強度的外界因素

 1.  激發(fā)光源：一般選用l_ex 最大

    但對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長波長，低 I₀ 及短時間光照

 2.  溫度：大多數(shù)分子在溫度升高時，分子與分子之間，分子與溶劑分子之間的碰撞頻率升高，非輻射能量轉移過程升高，F 降低，因此，降低溫度，有利于提高 F 。

 3.  溶液的 pH：帶有酸性或堿性環(huán)狀取代基的芳香組化合物的熒光一般都與 pH 值有關，有些化合物在離子狀態(tài)時不顯熒光。為此，在用熒光強度進行定量測定時，嚴格控制溶液 pH值是非常重要的。

4. 溶劑：對π

—π共軛的熒光物質(zhì)

在極性溶劑中，∆E 減小↓→ 躍遷幾率升高↑ → F↑（波長長移）

溶劑粘度 ↓ → F↓

5. 內(nèi)濾：當熒光波長與熒光物質(zhì)或其它物質(zhì)的吸收峰相重疊時，將發(fā)生自吸收使熒光物質(zhì)的熒光強度下降，此現(xiàn)象稱 “內(nèi)濾” 。

6. 散射光的影響（溶劑的二種散射）

（1）瑞利散射光：物質(zhì)（溶劑或其它分子）分子吸收光能后，躍遷到基態(tài)的較高振動能級，在極短時間（10^-12s）返回到原來的振動能級并發(fā)出和原來吸收光相同波長的光，這種光稱為瑞利散射光。

（2）拉曼散射光：物質(zhì)分子吸收光能后，若電子返回到比原來能極稍高（或稍低）的振動能級而發(fā)射的光稱為拉曼散射光。

    瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，拉曼散射與激發(fā)光波長不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關，因此可以通過選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長將拉曼散射光與熒光分開。

7. 熒光熄滅劑的影響：

    熒光熄滅：熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導致熒光強度降低的現(xiàn)象。

    熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。

如：X^-，重金屬離子、O₂  、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。

    尤其是溶液中的溶解氧能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除O₂ 。

8. 表面活性劑的影響：提高熒光強度。