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一、實驗目的
通過對好氣性自生固氮菌的計數，了解稀釋培養(yǎng)計數（MPN）的原理和方法。
二、實驗原理
最大或然數(most probable number，MPN)計數又稱稀釋培養(yǎng)計數，適用于測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類群。其特點是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾，并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該類群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細菌等。見附表23-1）的數量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的數量，缺點是只適于進行特殊生理類群的測定，結果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計數時才采用。
MPN計數是將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量（如lm1）的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖。根據沒有生長的最低稀釋度與出現(xiàn)生長的最高稀釋度，采用“最大或然數”理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數的近似值。具體地說，菌液經多次10倍稀釋后，一定量菌液中細菌可以極少或無菌，然后每個稀釋度取3—5次重復接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，將有菌液生長的最后3個稀釋度（即臨界級數）中出現(xiàn)細菌生長的管數作為數量指標，由最大或然數表（見附錄九）上查出近似值，再乘以數量指標第一位數的稀釋倍數，即為原菌液中的含菌數。
如某一細菌在稀釋法中的生長情況如下；
稀釋度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8
重復數 5 5 5 5 5 5
出現(xiàn)生長的管數 5 5 5 4 1 0
根據以上結果，在接種lO-3—10-5稀釋液的試管中5個重復都有生長，在接種lO-6稀釋液的試管中有4個重復生長，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數量指標為“541”，查最大或然數表得近似值17，然后乘以第一位數的稀釋倍數（10-5的稀釋倍數為100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌數＝17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌數為l700000個。
在確定數量指標時，不管重復次數如何，都是3位數字，第一位數字必須是所有試管都生長微生物的某一稀釋度的培養(yǎng)試管，后兩位數字依次為以下兩個稀釋度的生長管數，如果再往下的稀釋仍有生長管數，則可將此數加到前面相鄰的第三位數上即可。
如某一微生物生理群稀釋培養(yǎng)記錄為：
稀釋度 lO-1 10-2 10-3 lO-4 10-5 10-6
重復數 4 4 4 4 4 4
出現(xiàn)生長的管數 4 4 3 2 1 0
以上情況，可將最后一個數字加到前一個數字上，即數量指標為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×102個。按照重復次數的不同，最大或然數表又分為三管最大或然數表、四管最大或然數表和五管最大或然數表。
應用MPN計數，應注意兩點，一是菌液稀釋度的選擇要合適，其原則是最低稀釋度的所有重復都應有菌生長，而最高稀釋度的所有重復無菌生長。對土壤樣品而言，分析每個生理群的微生物需5—7個連續(xù)稀釋液分別接種，微生物類群不同，其起始稀釋度不同(見附表1)；二是每個接種稀釋度必須有重復，重復次數可根據需要和條件而定，一般2—5個重復，個別也有采用2個重復的，但重復次數越多，誤差就會越小，相對地說結果就會越正確。不同的重復次數應按其相應的最大或然數表計算結果。
若要求出土樣中每克干土所含的活菌數，則要將前述兩例中所得的每毫升菌數除以干土在土樣中所占的質量分數（烘干后的土樣質量／原始土樣的質量）。
計算式為：
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三、實驗器材
1. 土壤樣品：肥沃菜園土
2. 培養(yǎng)基：阿須貝（Ashby）無氮培養(yǎng)液(附錄三、15)22管(每管裝5ml，加1cm×4.5cm濾紙l條)
3. 器材：90ml無菌水（裝入250 ml三角瓶中，并裝有15—20個玻璃珠）、9ml無菌水、lml刻度無菌吸管、試管架、記號筆。
四、實驗方法
1．稱取10克土樣，放入90ml無菌水中，振蕩20min，讓菌充分分散，然后按十倍稀釋法將供試土樣制成10-1—10-6的土壤稀釋液。
2．將22支裝有Ashby無氮培養(yǎng)液的試管按縱4橫5的方陣排列于試管架上，第一縱列的4支試管上標以10-2，第二縱列的4支試管上標以10-3……第五縱列的4支管上際以10-6（即采用5個稀釋度，4個重復），另外2支試管留作對照。
3． 用lml無菌吸管按無菌操作要求吸取10-6的土壤稀釋液各lml放入編號10-6的4支試管中，再吸取10-5稀釋液各lml放入編號10-5的4支試管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀釋液各lml放入各自對應編號的試管中。對照管不加稀釋液。
4．將所有試管置28—30℃培養(yǎng)7天后觀察結果。
5．精確稱取3份10克稀釋用土，放入稱量瓶中，置105-110℃烘2h后放入干燥器中，至恒重后稱重，然后計算干土在土樣中所占的質量份數。
五、實驗作業(yè)：
培養(yǎng)7天后，取出試管，檢查實驗結果。
凡有固氮菌生長的試管，則培養(yǎng)液與濾紙接觸處有黑褐色或粘液狀菌膜，即為陽性，否則為陰性。對照管應為陰性。依次檢查每管生長情況，將結果填入下表，計算每克干土所含的活菌數。
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土壤稀釋度 |
10-2 |
10-3 |
10-4 |
10-5 |
10-6 |
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重復次數 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
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固氮菌生長管數 |
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數量指標 |
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干土的質量分數 |
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菌數近視值 |
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每克干土固氮菌數 |
個/克干土 |
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附表23-1 幾種主要微生物生理群MPN計數法一覽表
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微生物生理群 |
培養(yǎng)基 |
常用稀釋度 |
常用重復次數 |
培養(yǎng)時 間 (天) |
主 要 檢 查 方 法 |
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氨化細菌 |
蛋白胨氨化培養(yǎng)基 |
0-6—10-9 |
4 |
7 |
根據培養(yǎng)液加奈氏試劑后是否出現(xiàn)棕色或褐色，確定是否產生氨。 |
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亞硝酸細菌 |
銨鹽培養(yǎng)基 |
0-2—10-7 |
3 |
14 |
根據培養(yǎng)液加格利斯試劑Ⅰ及Ⅱ的反應，出現(xiàn)絳紅色證明有NO-2生成；或在培養(yǎng)中加鋅碘淀粉試劑及體積比值為20%的H2SO4，若出現(xiàn)藍色，證明有NO-3生成。 |
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硝酸細菌 |
亞硝酸鹽培養(yǎng)基 |
0-2—10-6 |
3 |
14 |
根據培養(yǎng)液加入濃硫酸及二苯胺試劑后，是否出現(xiàn)藍色，確定是否有NO-3生成。 |
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反硝化細菌 |
反硝化細菌培養(yǎng)基 |
0-4—10-8 |
3 |
14 |
根據杜氏小管有無氣體，確定有無N2生成；利用格利斯試劑Ⅰ及Ⅱ和二苯胺試劑、濃硫酸檢測有無NO-2生成及有無NH3存在，判斷反硝化作用進行情況。 |
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好氣性自生固氮菌 |
阿須貝無氮培養(yǎng)基 |
0-2—10-6 |
3 |
7-14 |
根據培養(yǎng)液表面與濾紙接觸處有無褐色或粘液狀菌膜生成，判斷有無好氣性自生固氮菌生長。 |
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好氣性 纖維素分解菌 |
赫奇遜噬纖維培養(yǎng)基 |
0-1—10-5 |
3 |
14 |
根據各試管中濾紙條上有無黃色或桔黃色菌斑出現(xiàn)及濾紙斷裂狀況，確定有無好氣性纖維素分解細菌的生長。 |
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厭氣性纖維素分解菌 |
嫌氣性纖維素分解細菌培養(yǎng)基 |
0-1—10-5 |
3 |
14-21 |
根據各試管中濾紙條上有無穿洞、破裂、完全分解情況，確定有無嫌氣性纖維素分解細菌的生長。 |
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硫化細菌 |
硫化細菌培養(yǎng)基 |
0-2—10-8 |
3 |
21-23 |
在每管培養(yǎng)液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出現(xiàn)，則證明有硫化菌活動。 |
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反硫化細菌 |
斯塔克反硫化細菌培養(yǎng)基 |
0-2—10-7 |
3 |
21-30 |
根據培養(yǎng)液試管底部、管壁有無黑色沉淀出現(xiàn)，判斷有無反硫化細菌活動。 |
